鸚形目性別核酸檢測(cè)試劑盒（帶內(nèi)參，PCR-熒光探針法  

本試劑盒可對(duì)鸚鵡的羽毛、血液及組織等樣品中CHD-W保守基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，進(jìn)而對(duì)鸚鵡性別進(jìn)行鑒定。通過引入內(nèi)源性內(nèi)參可對(duì)核酸提取和擴(kuò)增過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。  

產(chǎn)品內(nèi)容：  

儲(chǔ)存條件：  

-20℃條件下保存，有效期至少12個(gè)月。  

實(shí)驗(yàn)操作：  

1. 樣本制備（樣本制備區(qū)）  

1.1樣本要求：  

羽毛：采集胸部、腹部或腿部羽毛（含羽根部分）不少于5根，切勿使用自然脫落的羽毛。  

全血：使用EDTA作為抗凝劑，切勿使用肝素抗凝，要求使用新鮮全血，或在2~8℃不超過7天，或在-20℃條件下保存不超過3個(gè)月，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。  

組織：采取新鮮肌肉或器官組織（盡可能不使用皮或者筋膜等不易處理樣本）不超過100mg，使用200-500μL無(wú)菌水制備組織勻漿液，再進(jìn)行后續(xù)樣本制備。  

1.2樣本制備：  

請(qǐng)參照三獅生物《動(dòng)物基因組DNA快速提取試劑盒（PCR分析用）說明書》（貨號(hào)：DP202），或其他符合相關(guān)要求的核酸提取試劑盒/方法，對(duì)處理后的樣品進(jìn)行核酸提取。提取的樣品核酸放置于冰盒中，并盡量及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，4℃保存不超過7天或-20℃保存不超過6個(gè)月。  

2. 配制反應(yīng)體系（加樣區(qū)）  

2.1 取出試劑盒中各組分，室溫條件下完全解凍，離心10秒，將管壁和管蓋內(nèi)的液體離心至管底；按樣本數(shù)量（n+2）（即n個(gè)待檢樣本+1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照+1個(gè)陰性對(duì)照）配制反應(yīng)體系，具體配制方法如下：分別吸?。ǎ╪+2）× 11.5μL CW反應(yīng)液+（n+2）× 11.5μL CW預(yù)混液）加入潔凈離心管中，移液器吹吸充分混勻，分裝至PCR管中，每孔23μL，放在冰盒中備用。  

2.2 然后向反應(yīng)液中依次添加2μL陰性對(duì)照、提取的樣本核酸和CW陽(yáng)性對(duì)照，蓋好管蓋，做好記錄，每個(gè)反應(yīng)總體積為25μL。充分混勻，離心10秒后在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。  

3. PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）  

95℃預(yù)變性3分鐘；95℃變性10秒，58℃退火延伸30秒，35個(gè)循環(huán)，在58℃時(shí)收集熒光信號(hào)。熒光第一通道選擇FAM（CHD-W基因），第二通道選擇VIC/HEX（內(nèi)源性內(nèi)參基因）（使用ABI系列實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，若有需求可提前聯(lián)系廠家或自行添加ROX校正染料；否則參照正常程序進(jìn)行）。   

4. 結(jié)果判定  

4.1 陽(yáng)性對(duì)照FAM通道和VIC/HEX通道的Ct值均＜28且出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無(wú)Ct值或Ct值≥35且無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效；否則應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如重測(cè)實(shí)驗(yàn)仍無(wú)效，請(qǐng)與廠家技術(shù)人員聯(lián)系。  

4.2 樣本VIC/HEX通道的Ct值應(yīng)≤30且出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線，表明樣本提取和擴(kuò)增有效；如VIC/HEX通道無(wú)Ct值或Ct值為30＜Ct≤35，表明樣本核酸提取不達(dá)標(biāo)或存在較強(qiáng)抑制干擾物（如酒精等消毒劑、抗凝劑等殘留）抑制擴(kuò)增，建議重新處理樣本進(jìn)行核酸提取及擴(kuò)增；  

4.3 樣本VIC/HEX通道檢測(cè)有效后，再進(jìn)行FAM通道的判定：  

Ct值≤30且出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線，且兩通道Ct差值小于5，判定為CHD-W基因陽(yáng)性，表明樣本來源于雌性；  

Ct值≤30且出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線，但兩通道Ct差值≥5，或Ct值為30＜Ct＜32，則均判定為可疑，建議進(jìn)行復(fù)測(cè)（建議先排除環(huán)境氣溶膠污染導(dǎo)致的“假陽(yáng)性”結(jié)果，再重新進(jìn)行核酸提取及檢測(cè)），如排除氣溶膠污染后FAM通道復(fù)測(cè)Ct值＜30，且有明顯的擴(kuò)增曲線，兩通道Ct差值小于5，判定為CHD-W基因陽(yáng)性，否則判定為陰性；  

無(wú)Ct值或Ct值≥32且無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線，判定為CHD-W基因陰性，表明樣本可能來源于雄性。  

注意事項(xiàng)：  

1）為了防止污染，實(shí)驗(yàn)需要嚴(yán)格進(jìn)行分區(qū)操作，分區(qū)之間最好進(jìn)行物理性隔離，避免人為因素造成交叉污染。實(shí)驗(yàn)過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區(qū)域獨(dú)立使用工具，需更換手套和實(shí)驗(yàn)服。PCR結(jié)束后，切勿立即開蓋，充分冷卻后再開蓋取樣，最大程度避免氣溶膠污染。  

2）試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。試劑配制和加樣等步驟請(qǐng)嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行操作。操作臺(tái)、離心機(jī)及移液器等儀器應(yīng)定期使用含氯消毒劑、消毒酒精、核酸污染清除劑或紫外燈進(jìn)行消毒。  

3）檢測(cè)結(jié)果為陰性，并不完全代表為雄性，核酸樣本發(fā)生未知突變、質(zhì)量不合格、載量過低、存在較強(qiáng)干擾抑制物導(dǎo)致核酸提取（檢測(cè)）不成功亦會(huì)產(chǎn)生“陰性”結(jié)果。本試劑盒僅用于鸚鵡中CHD-W基因的特異性擴(kuò)增，涉及的其他產(chǎn)品請(qǐng)?jiān)斣兩a(chǎn)廠家。  

4）本品為一次性用品，試劑中的組分對(duì)于自然光較為敏感，分裝及保存時(shí)注意遮光，請(qǐng)勿反復(fù)凍融，僅供科學(xué)研究，不用于臨床診斷等其他用途。